Biotecnologie: DNA ricombinante, PCR e CRISPR

In quinta, al liceo scientifico e alle scienze applicate, la biologia dell’anno parte dalla biochimica e arriva alle biotecnologie fra novembre e dicembre. Se in classe state ancora su glicolisi e metabolismo, le biotecnologie sembrano lontane, ma il compito cade di solito fra sei e nove settimane da ora. Il capitolo è pieno di sigle e strumenti che si somigliano, e chi li impara a memoria senza capire chi fa cosa sbaglia le domande aperte.

Qui l’ordine è: DNA ricombinante, PCR con i suoi conti, elettroforesi, CRISPR-Cas9. Per le basi servono la replicazione, trascrizione e traduzione; chi viene dalla genetica classica trova la parte mendeliana nel post sul quadrato di Punnett.

L’idea di fondo: tagliare, incollare, copiare, leggere

Tutte le biotecnologie del programma si riducono a quattro verbi applicati al DNA:

1. tagliare in punti precisi;
2. incollare frammenti di origine diversa;
3. copiare un tratto di DNA in tante copie;
4. leggere e separare i frammenti per dimensione.

A ogni verbo corrisponde uno strumento: se ti chiedono “a cosa serve X”, chiediti quale verbo esegue.

Enzimi di restrizione: forbici con un indirizzo

Gli enzimi di restrizione sono proteine batteriche che riconoscono una breve sequenza di DNA, il sito di restrizione, e tagliano il filamento in quel punto. Nei batteri difendono dai virus. Tre fatti per il programma:

• il sito è quasi sempre palindromico: i due filamenti, letti entrambi 5’ → 3’, danno la stessa sequenza. Per EcoRI il sito è GAATTC e il filamento complementare, letto 5’ → 3’, è ancora GAATTC;
• il taglio può essere sfalsato e lasciare estremità coesive (“sticky ends”), cioè corte code a singolo filamento complementari tra loro, oppure netto (estremità piatte);
• due frammenti tagliati con lo stesso enzima hanno estremità compatibili, quindi si possono unire, anche se vengono da organismi diversi.

L’ultimo punto è quello che rende possibile tutto: un gene umano e un plasmide batterico, tagliati con lo stesso enzima, hanno code che si appaiano per complementarità.

DNA ricombinante: il procedimento passo passo

Obiettivo tipico: fare produrre a un batterio una proteina umana, per esempio l’insulina. I passaggi nell’ordine in cui li chiede il professore:

1. Si isola il gene di interesse (o lo si ottiene da mRNA con la trascrittasi inversa, così da avere un gene senza introni, adatto a un batterio).
2. Si prepara il vettore. Il vettore più usato è il plasmide: piccola molecola di DNA circolare che si replica da sola nel batterio. Ha un’origine di replicazione, un gene di resistenza a un antibiotico e un tratto con più siti di restrizione ravvicinati.
3. Si taglia gene e plasmide con lo stesso enzima di restrizione.
4. Si mescolano: le estremità coesive si appaiano.
5. La DNA ligasi salda i legami fosfodiesterici e chiude lo scheletro zucchero-fosfato. L’appaiamento delle code è temporaneo, la ligasi lo rende permanente.
6. Trasformazione: il plasmide ricombinante viene fatto entrare nei batteri (con shock termico o elettrico).
7. Selezione: si piastrano i batteri su terreno con l’antibiotico. Sopravvivono solo quelli che hanno preso un plasmide, perché il plasmide porta la resistenza.
8. Espressione: i batteri crescono, si dividono e producono la proteina.

Al punto 7 c’è una trappola: la resistenza seleziona chi ha preso un plasmide, non chi ha preso un plasmide con il gene inserito, perché un plasmide richiuso su se stesso resiste lo stesso. Per distinguere i due casi si usa un secondo marcatore.

Chi fa cosa: la tabella da imparare

Questa è la zona dove cadono più risposte. Tre enzimi che lavorano sul DNA e che si confondono:

La restrizione è la forbice, la ligasi la colla, la polimerasi la fotocopiatrice. Una DNA polimerasi non parte mai da zero: ha bisogno di un innesco (primer) con un 3’-OH libero da cui allungare. È questo il punto che porta direttamente alla PCR.

La PCR: fotocopiare un tratto di DNA

La reazione a catena della polimerasi (PCR) amplifica un tratto scelto di DNA a partire da quantità minime. Ingredienti: il DNA stampo, due primer che delimitano il tratto da copiare, i quattro nucleotidi e una DNA polimerasi termostabile, la Taq, estratta dal batterio Thermus aquaticus, che vive in acque calde. Una polimerasi normale si denaturerebbe già al primo riscaldamento.

Ogni ciclo ha tre tappe, che si ottengono solo cambiando la temperatura:

1. Denaturazione, circa 94-95 °C: il calore rompe i legami a idrogeno fra i filamenti e il DNA diventa a singolo filamento.
2. Appaiamento (annealing), circa 50-65 °C: i primer si legano alle sequenze complementari sullo stampo.
3. Estensione, circa 72 °C: la Taq allunga i primer aggiungendo nucleotidi.

Le temperature variano con primer e protocollo: in verifica contano l’ordine alto-basso-medio e che cosa succede in ciascuna tappa.

Il conto: $2^n$

Se ogni ciclo raddoppia le molecole, dopo $n$ cicli da una sola molecola di partenza se ne hanno

dove $N_0$ è il numero iniziale di molecole stampo. È una crescita esponenziale: i primi cicli sembrano poca cosa, gli ultimi sono enormi. Nei primissimi cicli compaiono anche frammenti più lunghi del tratto voluto, quindi il numero esatto di quelli “della lunghezza giusta” è un po’ inferiore: al liceo si usa il modello ideale $2^n$, salvo diversa indicazione.

Errore tipico. Scrivere $n\cdot 2$ al posto di $2^n$, cioè trattare la PCR come una crescita lineare. Con 30 cicli la differenza è fra 60 e un miliardo.

L’elettroforesi su gel: leggere i frammenti

Dopo la PCR o dopo una digestione con un enzima di restrizione bisogna capire che cosa si è ottenuto. L’elettroforesi su gel separa frammenti di DNA in base alla lunghezza:

• il DNA ha carica negativa (per i gruppi fosfato), quindi migra verso il polo positivo (anodo);
• il gel è una rete che ostacola le molecole: i frammenti più corti si muovono più velocemente e arrivano più lontano dai pozzetti, quelli più lunghi restano indietro;
• in una corsia a parte si carica un marcatore di peso molecolare (ladder), una miscela di frammenti di lunghezza nota, con cui si stimano le lunghezze degli altri;
• le bande si vedono con un colorante che si lega al DNA, sotto luce ultravioletta.

CRISPR-Cas9: un’editor di DNA guidato da RNA

CRISPR-Cas9 nasce come sistema immunitario dei batteri contro i virus: il batterio conserva frammenti del DNA virale e li usa per riconoscere e tagliare il virus se ritorna. Come strumento di laboratorio si usa così:

• RNA guida (gRNA): una breve sequenza, che disegni tu, complementare al tratto di DNA che vuoi colpire;
• Cas9: la nucleasi, la proteina che taglia entrambi i filamenti del DNA nel punto indicato dalla guida;
• serve anche una breve sequenza vicina al bersaglio, chiamata PAM, che Cas9 riconosce prima di tagliare.

Dopo il taglio a doppio filamento, la cellula ripara da sola e qui ci sono due strade:

1. riparazione “veloce” e imprecisa (giunzione delle estremità non omologhe): spesso introduce piccole inserzioni o delezioni che spengono il gene, utile per inattivarlo;
2. riparazione guidata da uno stampo (ricombinazione omologa): se fornisci un DNA stampo con la sequenza voluta, la cellula lo copia nel punto del taglio, utile per correggere o inserire una sequenza.

Restrizione e CRISPR tagliano entrambi, ma l’enzima riconosce un sito che non scegli, mentre in CRISPR la specificità sta nella guida, che puoi progettare per quasi qualunque punto del genoma.

OGM in due righe

Un organismo geneticamente modificato ha il genoma alterato con ingegneria genetica; se contiene geni di un’altra specie è transgenico. Esempi da libro: batteri che producono insulina umana, piante resistenti a un parassita. Se ti chiedono vantaggi e rischi, elenca entrambi in modo specifico (ambiente, brevetti, sicurezza alimentare, accesso alle cure).

Tre esercizi svolti

Esercizio 1: un ciclo di PCR

Da una molecola di DNA a doppio filamento, con un ciclo ideale, quante molecole ottieni dopo 30 cicli? Quante dopo 10?

Dopo $n$ cicli ideali, $N=2^n$ per una molecola di partenza.

Con $n=10$:

Con $n=30$:

Dopo 30 cicli le copie sono più di un miliardo: è per questo che la PCR rende visibile un bersaglio presente in una sola molecola.

Esercizio 2: partire da più molecole

Un campione contiene 500 molecole stampo. Dopo 10 cicli ideali quante molecole ci sono? Quanti cicli servono, come minimo, per superare 10 milioni di molecole?

Per il secondo quesito si cerca il più piccolo $n$ tale che $500\cdot 2^n>10^7$, cioè $2^n>20000$. Siccome $2^{14}=16384$ è ancora sotto e $2^{15}=32768$ è sopra, servono 15 cicli. Controllo: $500\cdot 32768=16384000$, che supera i dieci milioni.

Esercizio 3: leggere un’elettroforesi

Un plasmide circolare di 4000 paia di basi (bp) ha due siti EcoRI. Lo digerisci con EcoRI e ottieni due frammenti: 1200 bp e 2800 bp. Li carichi su gel in una corsia, con un marcatore con bande da 500, 1000, 2000 e 3000 bp in un’altra corsia. Che cosa vedi?

1. I due frammenti sono la somma del plasmide: $1200+2800=4000$ bp, coerente. Un plasmide circolare con due tagli dà due frammenti (con un solo taglio avrebbe dato una sola molecola lineare da 4000 bp).
2. Il DNA ha carica negativa: migra verso il polo positivo, quindi le bande si dispongono fra i pozzetti (polo negativo) e il fondo del gel.
3. Il frammento da 1200 bp è più corto, quindi va più lontano: si trova fra le bande del marcatore da 1000 e da 2000, un po’ più vicino a quella da 1000.
4. Il frammento da 2800 bp si trova fra le bande da 2000 e da 3000, più vicino a quella da 3000.

Risultato: due bande, quella da 1200 bp più in basso e quella da 2800 bp più in alto. L’errore classico, davanti alla foto di un gel, è dire che la banda più in basso è la più lunga: è l’opposto.

Per allenarti, nelle simulazioni di verifica per il liceo trovi domande a risposta chiusa: la risposta corretta è gratis, la soluzione guidata si sblocca con la prima lezione.

Gli errori che ricorrono

• Confondere ligasi e polimerasi. La ligasi salda due frammenti già esistenti, la polimerasi costruisce un filamento nuovo da un primer.
• Dire che gli enzimi di restrizione “tagliano a caso”. Riconoscono sequenze precise.
• Dimenticare perché si usa la Taq. Sopporta le temperature della denaturazione.
• Scrivere $2n$ invece di $2^n$, o invertire il verso della migrazione nel gel.
• Presentare CRISPR come una forbice e basta. Il punto è la guida di RNA che sceglie dove tagliare.

Come arrivarci preparato

La logica tagliare-incollare-copiare-leggere permette di ricostruire quasi ogni risposta senza liste di nomi. Il quadro dell’anno è in scienze; per i legami con il resto del programma servono glicolisi, Krebs e fosforilazione ossidativa e l’evoluzione di Darwin.

Se vuoi una mano a ordinare la materia prima del compito, chiedi la diagnosi gratuita dalla pagina dei contatti: in una chiacchierata capisco dove si inceppa il ragionamento e come impostare le settimane che restano.